论承认和执行外国判决中公共秩序的运用
严海 浙江大学法学院
[内容摘要]:公共秩序是拒绝外国判决承认和执行的理由之一,由于其标准难以确定,在实际运用中遇到了诸多困难。目前国际上还没有就这一问题达成广泛接受的公约,美国和欧盟在这一问题上都采取限制适用的政策,而中国的相关立法还存在一定的不足。由于具有的不可替代的作用,公共秩序必将继续在承认和执行外国判决中发挥重要作用。
[关键词]:承认和执行外国判决 公共秩序 海牙公约 布鲁塞尔公约
一、基本问题概说
(一)有关承认和执行外国判决的基本问题
一国法院的判决本应只在法院地国发生效力,但是随着各国交往的日益密切,任何国家为了自身利益,都不得不承认外国的民商事判决在本国具有法律效力。到底是什么原因促成一个国家承认和执行外国法院判决,学者们提出过不同的理论学说,包括国际礼让说、即得权说、债务说、特别法说、互惠说和一事不再理说等〔1〕。但是究其本质还是因为承认和执行外国法院的判决符合国际民事发展的需要,因而各国为了及时妥善处理涉外民商事案件,维护本国法律的权威,无不积极谋求私法领域的国际合作,在不损害国家主权的前提下,相互承认和执行他国法院的判决。〔2〕
当然,承认和执行外国判决并不是无条件的。由于各国在政治制度、法律意识,以及司法组织方面有很大的差异,同时由于执行外国判决会给内国带来的各种冲击,在所有国家的国内立法以及有关的国际条约中,都规定了承认和执行外国法院判决时应遵守的条件,这些条件包括原判决国法院必须具有合格的管辖权、外国法院判决已生效、外国法院进行的诉讼程序是公正的、承认和执行外国判决不违反内国公共秩序等〔3〕。在这些众多标准中,有关公共秩序的适用由于范围难以确定,非常灵活,在实践判断中往往难以把握,是承认和执行外国判决中的一个重要问题。
(二)有关公共秩序的基本问题
公共秩序,英美法系又称“公共政策”〔4〕,是国际私法上的一项基本制度,已为国际社会普遍承认和采用。从狭义上说,公共秩序主要是指法院在依自己的冲突规范本应适用某一外国法作准拒法时,因其适用的结果与法院地国的重大利益、基本政策、基本道德观念或法律的基本原则相抵触而拒绝或排除适用该外国法。而一般学者都认为,广义的公共秩序概念还应包括内国可以拒绝承认与执行违背内国公共秩序的外国法院判决或外国仲裁机构作出的裁决〔5〕。外国法院的判决不与内国的公共秩序相抵触,这是国际社会普遍公认的承认和执行外国判决一个条件,各国法律均作了明确规定。因为公共政策条款是一种保护性条款,各国规定这一条款,都是为了保护内国国家的重大利益,维护内国的基本政策及道德与法律的基本观念和基本原则,使他们不至于因为外国法院判决在内国的承认与执行而受到威胁和动摇〔6〕。
同时,与外国仲裁裁决的承认和执行比较而言,一国法院对涉外民事案件作出的判决要得到外国的承认和执行,所需条件和审查程度都会更加复杂,其原因主要是司法诉讼和仲裁的性质不同,仲裁机构纯粹是民间机构,裁决的作出也往往体现了当事人的意愿,而法院是国家机构的重要组成部分,其管辖权具有强制性,作出的判决也是国家行为的范畴。〔7〕再加上承认和执行仲裁裁决的公约更具有广泛性和普遍性,因此各国在援引公共秩序时往往比较谨慎,但在外国判决的承认和执行中,公共秩序则成为一种惯用的抵制手段,其涉及到的问题也就更加复杂。
二、有关运用公共秩序拒绝承认和执行外国判决标准的几个问题
公共秩序既是用以拒绝使用外国法的一种传统理由,也是用以拒绝执行外国仲裁裁决和外国判决的一种重要依据,几乎与之有关的每一项条约都订有公共秩序条款。从某种程度上说,公共秩序是一国维护其自身利益不受侵害的最强有力的一道防卫线。一方面,由于公共秩序实际内容的不确定性,其范围可以界定得相当广泛;另一方面,由于公共秩序内容的含糊性和多变性,其适用时法院和法官具有极大的自由裁量权。正因为如此,尽管各国对公共秩序普遍都已作了规定,但要明晰地界定它的内涵和外延,规定其适用的标准和范围,却是十分困难的,给其下一个明确的定义也是不可能的〔8〕。但在运用公关秩序作为拒绝承认和执行外国判决的理由时,必须注意以下几个问题:
(一)拒绝承认和执行外国判决的依据应为国际公共秩序
许多国际的立法和司法实践都承认国际领域中的公共秩序与国内公共秩序的区别,他们认为,在内国案件中适用的国内公共秩序理由可能是合适的,但国际领域的公共秩序应比国内公共秩序受到更多的限制,一般只违反有关国家真正根本的法律秩序观念时才得以适用。在承认和执行外国仲裁方面,《纽约公约》就将《日内瓦公约》中与公共政策并列的作为拒绝承认和执行裁决理由的“一国法律的基本原则”删去,目的是减少拒绝承认和执行的情况,从立法旨意看,其使用的公共秩序应该是国际公共秩序。〔9〕尽管执行外国判决方面还没有一个广泛参与的公约,但从国际私法的发展方向看来,将公共秩序限定在国际公共秩序是一致的共识〔10〕,在执行外国判决领域也是如此。尽管本国法律无此规定,或规定与外国相反,只要该判决的执行不会对内国的公共利益造成威胁,不会对内国有关善良道德和公共福利的基础造成破坏,就应该予以执行。
当然,认定某一判决违反公共秩序,还是由执行地的法院进行的,其有权适用本国公共秩序审查判决的执行效力。因此,认定是否违反公共秩序,其适用的法律仍然是执行地国的法律,但是是以国际公共秩序为标准来决定外国判决的可执行性,这点并不矛盾,因为国际公共秩序一般都是被一国的国内法承认的。〔11〕所以将国际公共秩序作为标准并不代表与内国公共秩序无关,只是对公共秩序的运用采取更严格的标准,而一般学者在表述上还是使用“法院国的公共秩序”这一说法。
(二)拒绝承认和执行外国判决是因为其执行结果将有损公共秩序
关于适用公共秩序的标准是外国法院的判决本身违反了公共秩序,还是承认和执行的结果违反了公共秩序,国际社会的做法并不统一。〔12〕有的国家法律和国际公约规定,外国法院判决本身不得违背内国的公共秩序,如《日本民事诉讼法》第200条第3款规定承认和执行外国判决的条件之一是:“外国法院的判决,不违背公关秩序和善良风俗”;1982年前《南斯拉夫法律冲突法》第91条规定:“外国法院的判决如违反南斯拉夫宪法规定的社会组织的基本原则,则不应承认。”;1979年美洲国家《关于外国判决与仲裁裁决的域外效力的公约》第2条规定:“凡第1条所指的外国判决、裁决与决定,符合下列条件者,在各成员国均应有域外效力:……不与要求其承认和执行它们的国家的公共政策(公共秩序)的原则与法律存在明显的抵触。”;从我国《民事诉讼法》第268条的规定来看,我国也是属要求外国法院判决本身不得违反内国公共秩序的国家之列。也有的国家法律和国际公约规定,对外国法院判决的承认和执行的结果将有损于内国的公共秩序,内国法院才拒绝承认和执行,如1987年《瑞士联邦国际私法法规》第27条第1款规定:“如果对外国判决的承认明显地不符合瑞士的公关秩序,在瑞士应拒绝承认该判决。”;1971年海牙《关于承认与执行外国民事和商事判决的公约》第5条第1款规定:“承认或执行判决与被请求国的公共秩序明显不相容,或者判决时在未予任何一方当事人充分机会陈述意见的情况下作出的,可以拒绝承认和执行该外国法院的判决。”
对这两种立法例进行比较,不难看出第二种方案,即要求承认和执行外国法院判决时不与内国的公共政策相抵触的做法是比较妥当的,这主要是因为各国之所以规定公共秩序这一例外条款,完全是为了保护内国国家的重大利益,维护内国的基本政策及道德与法律的基本观念和基本原则,使他们不至于因为外国法院判决在内国的承认和执行而受到威胁和动摇,问题的关键不是在抽象的外国判决,而是在具体执行外国法的结果如何,因此以执行结果作为标准在维护了公共秩序的同时也有利于个案的公正解决。例如一外国法承认一夫多妻制,而内国法律主张一夫一妻制,如果在对该丈夫遗产的判决中涉及数个妻子的继承问题时,尽管外国法的一夫多妻制与法院地公共秩序相抵触,而执行时采取结果说,给予执行该判决,显然就更为合理。〔13〕
(三)此处的公共秩序与排除外国法适用中公共秩序的范围是相同的
公共秩序原则在排除执行外国判决中和其在排除外国法适用中所起的作用与范围相比,在一些人看来要小一些,因为承认外国判决只是承认已从国外获得的权利,因而在这里坚持公共秩序的需要程度也比获得实体权利时小。正因为此,“法国法院可以承认解除婚姻的外国判决的效力,同时,却在配偶双方的所属国法律允许解除婚姻时,却仍然拒绝解除有关的婚姻。”〔14〕但是,我们也必须看到,在外国法律规范的适用方面,涉及的是外国法律规范的一般性的问题,而在外国判决的执行方面,涉及的是外国法律规范的具体个别的问题,公共秩序在两种情况下是一致的,只是层面不同,而作用和强度也是一致的。
三、关于承认和执行外国判决中公共秩序运用的国际立法概况
调整外国判决的承认与执行的法律既包括国内法,也包括国际公约、地区性公约和双边协定,然而这两些法律渊源的关系本来就非常复杂,相关规则相互冲突的现象也屡见不鲜,从而导致域外的商事活动成本大大增加。下面就分别介绍在承认和执行外国判决中规定公共秩序运用最具代表性和影响力的国际立法、司法实践,即海牙国际国际私法会议制定的公约、美国的判例体系以及欧盟的地区性公约。
(一)海牙公约的规定
由于各国对承认和执行外国法院判决的规定存在很大差异,为了保护当事人利益,促进国际合作,国际社会致力于通过条约方式,统一规定这种制度。海牙国际私法会议一直致力于制定一个广泛参与的有关外国法院判决承认和执行的专门公约,并于1972年通过了迄今为止最富有创造性、合理性和完整性的专门性国际公约《关于承认与执行外国民事和商事判决的公约》〔15〕,该公约在第5条对公共秩序的规定在前文已经引用,然而由于加入国太少,这个公约所起的实际效果微乎其微。近年以来,国际社会一致呼吁制定一个新的公约,但是各国存在分歧较多,直至2001年才推出了新的草案,但是因分歧依然存在,新草案仍被搁置〔16〕,现在起草委员会已经意识到要使更多国家参与,必须对条约内容进行削减,尽量使各国能达成一致的地方成为公约最终条文,各国在公共秩序作为一项重要的条文并无异议,如果公约能够被大多数国家签署,必然可以使外国判决的执行更加便利。
(二)美国的规定
作为判例法国家,美国早在1895年的希尔顿诉吉欧案(Hilton v. Guyot)〔17〕中确立了执行外国判决中的公共政策例外原则,当然法院也意识到这种例外原则很容易被滥用,被告可能会在外国法院与美国法院判决不同就要求援用公共政策条款拒绝执行该判决,因此在实践中很少应用,并设立了很多的标准。在阿克曼诉赖文案(Ackerman v. Levine)中,法官指出“适用公共政策例外的标准是很高的,实际中很少满足”〔18〕;在洛克斯诉标准石油公司案(Loucks v. Standard Oil Co.)中,法官指出“并不因为该案依本地法院判决与其他地方法院不同就拒绝执行其判决”〔19〕;在湖人航空公司诉比利时世界航空公司案( Laker Airways Ltd. v. Sabena, Belgian World Airlines)中,法官也同样指出,“以公共政策理由拒绝判决执行的标准是非常严格的”〔20〕。这一系列的案件都表明,美国法院并不会因为一个案件在外国的判决与该案在美国的判决不同而拒绝执行,只有当外国判决有损公共健康、公共道德、公众对法律的信仰等重大事由,才可援用公共政策来拒绝执行。
虽然至今还没有一个美国法院在其判例中列举出适用公共政策的明确标准,但是通过一系列判例,也确立了在哪些情况下应适用公共政策拒绝执行外国判决,哪些情况下应该适用公共政策原则。具体得说,以公共政策为由拒绝适用外国法的情况主要有:
第一,带有刑事惩罚性质的判决。在菲律宾诉威斯丁豪斯电器公司案(Republic of the Philippines v. Westinghouse Electric Corp.)中,新泽西地方法院认为菲律宾法院判决中超出了对原告损害的赔偿,明显带有刑事惩罚性质,不应执行。〔21〕这与刑事案件的判决一般得不到域外执行的道理相似。
第二,原告的不当行为引起的被告赔偿判决。这类判决在美国比较常见,比如在杰夫诉斯诺案(Jaffe v. Snow)中,由于原告在保释期内违反保释规定以致受到了被告的侵害,法院拒绝执行加拿大法院的要求被告赔偿的判决,认为是原告自己的过错导致了该侵害〔22〕,法院这样做是害怕执行这类判决就等于是承认了原告先前的行为合法的,从而构成对美国司法信仰的一种挑战。
第三,诽谤案的判决。在外国诽谤案的判决依据的标准与美国公共政策相违背时,美国就会援用公共政策例外条款拒绝执行该类判决,比如美国就曾拒绝执行一个英国法院的诽谤案判决,因为在英国,即使被告的言论是完全真实,披露的时候也没有任何疏忽责任,也必须承担责任,而美国认为这样的判决是侵犯了被告的宪法权利,即自由言论权,从而不予执行〔23〕。
从上面的判例可见,美国对公共政策在拒绝执行外国判决中的运用非常之谨慎,还有大量的判例中美国法院拒绝了被告要求法院援用公共政策,比如执行归还赌债的判决〔24〕,执行外国法院先予执行的判决〔25〕等,虽然这些判决的内容在执行地法律并无规定,甚至是做了相反的规定,但美国法院认为执行这些判决不至于损害公共政策,依然给予这些判决在美国的执行力。
(三)欧盟的规定
法律的统一是欧洲实现一体化的重要内容,早在1968年,欧洲经济共同体国家于布鲁塞尔制订了《民商事司法管辖权和判决执行公约》,该公约第27条规定,缔约国有权拒绝承认外国判决如果承认该判决违反该国的公共秩序。1988年欧洲自由贸易联盟又以布鲁塞尔公约为蓝本,在卢加诺制订了一项新的《民商事司法管辖权和判决执行公约》,并在公共秩序上作出了同样的规定。根据布鲁塞尔公约的第三议定书的规定,对该公约的解释权在欧洲法院。同美国法院的做法一致,欧洲法院在公共秩序在拒绝承认和执行外国判决中的运用也进行了狭义的解释,从某种意义上说,其适用的范围较美国更加狭窄,因为现有的司法实践表明,通常只有在判决违反了布鲁塞尔公约的正面规定,才以公共秩序为由拒绝执行。比如,布鲁塞尔公约第27条第2款规定,缺席判决如果没有经过对被告的适当通知,则不予执行。德国法院就曾以荷兰法院对被告未尽合理通知义务就作出的判决违反公共秩序为由,拒绝执行该判决。〔26〕
布鲁塞尔公约还有一个值得注意的地方在于它规定了在一些情况下不能以公共秩序为由拒绝执行外国判决,第28条第3款规定,不能仅以外国判决是由不具管辖权的法院做出为由而援用公共秩序例外条款。这主要是出于提高判决执行效率的角度考虑,欧洲法院也在其判决中强调,执行地法院不应审查原判决法院的管辖权。欧洲法院对公共秩序的态度非常谨慎,这种以事实和条文作为依据的做法使得公共秩序原则不会被滥用。〔27〕
在欧盟,除了统一立法之外,欧洲各国都有自己关于承认和执行外国判决的相关立法,其基调是与布鲁塞尔公约一致的。但这里需要特别强调的是关于惩罚性赔偿的判决的执行的问题,惩罚性赔偿在普通法系国家尤其是美国应用极为广泛,欧洲大陆的国家由于强调民事赔偿的补偿性,对美国法院的这类判决往往持否定的态度,而他们拒绝执行这类判决的理由就是公共秩序原则,但是近年来,包括德国和瑞士在内的一些国家也开始执行这类的判决,其前提是要有确凿证据证明一笔惩罚性赔偿金主要用于补偿而不是单纯的惩罚。〔28〕
四、公共秩序在中国的运用及其展望
(一)我国的规定
我国在各种法律条文中都没有使用公共秩序的概念,但在需要的地方都作了相关的规定,在承认和执行外国判决中,我国民事诉讼法第268条规定,人民法院对申请或者请求执行的外国法院作出的发生法律效力的判决、裁定,违反中华人民共和国法律的基本原则或者国家主权、安全、社会公共利益的,不予承认和执行。虽然规定也比较笼统,但是也是将公共秩序的运用设立了较为严格的标准,在实践中具有积极的作用。另外,我国在承认和执行外国判决中起重要作用的双边司法协助条约中,也都规定了公共秩序条款,例如《中华人民共和国和法兰西共和国关于民事、商事司法协助的协定》第二十二条规定:“对有下列情形之一的裁决,不予承认和执行:……(五)裁决的强制执行有损于被请求一方的主权、安全或公共秩序;……”;《中华人民共和国和意大利共和国关于民事司法协助的条约》第二十一条规定:“除下列情形外,裁决应予承认并被宣告可予执行:……(六)裁决中包括有损于被请求的缔约一方的主权、安全或公共秩序的内容。……”。
从上文的讨论中我们不难看出,我国现行的规定,主要存在以下几点需要进一步完善:第一、没有在立法上使用“公共秩序”这一概念,仅用“国家主权、安全、社会公共利益”代替公共秩序的概念,不是很明确,也不是国际通行的做法,公共秩序的内涵已经被广为接受,既然在司法协助条约中可以使用这个概念,在国内法条文中也应该统一使用这一名称;第二,没有采用结果说,直接规定外国法院的判决、裁定违反了公共秩序就不予执行,而不是从执行的结果考虑;第三,没有立法或司法解释对公共秩序的运用作出指导性的解释,虽然公共秩序条款之所以受到各国的重视主要是因为其具有不确定性,是个自由裁量的弹性条款,在因事、因地、因时的不同而灵活适用而起到保护国家利益的作用,不可能要求立法者穷尽适用公共秩序的情况,但我国作为成文法的国家,判例是不具有法律效力的,就造成了公共秩序条款比较空洞,很容易在司法实践中导致有的法院任意对“社会公共利益”作宽泛解释,扩大该制度的适用,以是否损害地方利益或部门利益作为评判外国判决的执行是否违背“社会公共利益”的尺度,这将严重损害了中国的声誉,阻碍正常的对外经济交往。
(二)对公共秩序在承认和执行外国判决中运用的展望
在拒绝承认和执行外国判决的理由中,公共秩序是最不确定、最广泛的因素。而鉴于公共秩序“安全阀”的作用,虽然人们都很担心该例外会被滥用,但其在承认和执行外国判决的各种双边、多边条约中的作用是不可替代的。目前国际社会都倾向于限制该原则的适用,而且都把公共秩序当作拒绝承认和执行外国判决的“最后防线”〔29〕,只有在其他措施不能保护一国利益之时,才运用公关秩序例外。确实,公共秩序与其它拒绝外国判决的理由相比,不是用来保护某一方当事人的利益,而完全是从国家利益的整体考虑的,从这个角度来看,限制公共秩序在承认和执行外国判决中的运用是很合理的。随着各国经济交往的不断增多,涉外民事判决的日益普遍,公共秩序在承认和执行外国判决中的作用是不会减弱的,只有依靠各国加强合作,对其形成较为统一的认识,才能促进国际民事交往的进一步发展。
药品卫生检验方法
卫生部
药品卫生检验方法
卫生部
第一章 药品卫生检验通则
一、供试品取样及注意事项
1.供试品取样应有一定数量,以使检验结果具有代表性。因此,正常的供试品,一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位。检验时,每次最少应分取两瓶(盒)以上的样品共10克或10毫升,中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克;贵重或微量包装的供试品,取样量可酌减
。
2.凡异常的供试品,则选取有疑问的样品进行检验。
肉眼能看出发霉生虫变质、活螨的样品,应判为不合格,无需再作抽样检验。
3.检查活螨的样品抽样量,见活螨的检验法。
4.供试品在检验前,应严格保持包装的原有状态,不得启开,防止再污染。并放在阴凉干燥处,防止微生物再繁殖,以免影响检验结果。凡已将原包装启开,则无代表性,应另行取样。
5.供试品在检验过程中,从开封至全部检验操作结束,须防止微生物再污染和扩散。凡直接与样品接触的用具,均应事先灭菌并保持无菌;全部操作须在无菌室内进行,或在相应的条件下,按无菌操作规定进行。
6.供试品稀释后,须在1—2小时内操作完毕,防止微生物繁殖或死亡。
7.供试品稀释成供试液后,应在均匀状态下取样。凡因抑菌或不溶于水的剂型,其供试品应作特殊处理后进行检验。
8.从供试品检出大肠杆菌或其它致病菌的报告发出起,该菌种保存一个月备查。如有疑问,可送药检部门或上一级药检单位复核。
二、供试品制备
1.凡固体样品,应称取10克,加在100毫升稀释剂(生理盐水或磷酸盐缓冲液)中,经充分研磨或振摇制成供试液。液体样品,则可量取10毫升加在90毫升稀释剂中,混匀后成供试液。
2.凡含有防腐剂或抑菌成份且影响检验的供试品,可经离心沉淀集菌法及其他适宜的方法处理后,检验大肠杆菌和其他致病菌。集菌处理法如下:
取供试液10毫升,以无菌手续放在灭菌的尖底刻度离心管中,经每分钟3500转以上离心沉淀30分钟,用灭菌毛细吸管吸取上清液弃掉,并留下管底的2毫升残余液,将其全部洗净加在培养基中,进行增菌检验。含有不溶性药渣的样品稀释液,可均匀吸取10毫升放在离心管中
,先经每分钟500转左右离心沉淀5分钟,取其上清液放在另一灭菌尖底刻度离心管中,再经每分钟约3500转以上离心沉淀30分钟,轻轻吸取上清液弃掉,取其管底的2毫升残余液全部洗净加在培养基中,增菌检验即得。
3.非水溶性的软膏、乳膏、油膏剂等,可称取样品5克,放在乳钵或烧杯中,加8毫升灭菌的吐温—80充分研磨匀后,加入经140°干热灭菌半小时的西黄蓍胶2.5克研磨匀。再加少量45°的稀释剂充分研磨,使呈均匀乳剂。随后边加入稀释剂边研磨,使成100毫升乳剂
,移至三角瓶中,即为1∶20供试液。
或称取供试品2.5克,分别量取液体石蜡10毫升,吐温—80.10毫升,稀释剂30毫升。先将供试品置乳钵中,边研磨边滴加液体石蜡;然后再边研磨边滴加吐温—80,研磨均匀后;再边加入稀释剂边研磨,开始每次约1毫升,待起团块时,加入稀释剂3毫升,稍停一分钟
,再轻轻研磨至乳化,将稀释剂加完为止,即得1∶20供试液。
4.滤膜法:取规定量的供试品,按1毫升加入灭菌生理盐水50毫升左右,摇匀,用灭菌吸管或注射器注入薄膜过滤器内,减压抽干后,用灭菌生理盐水或其他适宜的溶剂冲洗薄膜3次,每次50毫升。取出薄膜,剪成几条,加至10毫升灭菌稀释剂中,充分摇动,使成供试液。可
供细菌、酵母菌和霉菌计数用。或将剪成几条的上述薄膜加至有关的增菌培养基中培养,可供检查绿脓杆菌或金黄色葡萄球菌用。
三、阳性菌株对照试验
1.为便于研究观察成药制剂中,某些含有防腐剂和抑菌成份的干扰作用,以及测试常规检验方法和培养基、试剂等的灵敏度时,可将定量的已知阳性对照菌加在供试品稀释液中,按检验供试品的操作方法进行阳性菌的对照试验。阳性对照菌应生长。
2.常用的阳性对照菌株,卫生部检定所编号:大肠杆菌44102、沙门氏菌50094、绿脓杆菌10104、金黄色葡萄球菌26003和破伤风杆菌64067等。
3.对照试验加入的已知活菌量,每批供试品应控制在50—100个范围之内,需氧菌常用的计数方法,如金黄色葡萄球菌可用37℃培养18—20小时
-6
新鲜肉汤培养物,十倍递增稀释至10 ,取其0.1
-7
毫升按琼脂平板表面涂抹法或取10 稀释液1毫升按浇碟法进行活菌数测定。按每毫升菌液内所含的活菌量,取适量加在供试品里,对照检验即得。破伤风杆菌的阳性对照以作毒力试验为主(具体操作见破伤风杆菌检验项下。)
4.作阳性菌株对照试验时,应注意安全,严格防止对照菌污染供试品和环境。为此,加入阳性菌的操作可在另外无菌室或其他适宜的地方进行。
第二章 药品卫生检验法
一、细菌总数测定法
细菌总数的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染的活菌数量。测定结果便于判明供试品被细菌污染的程度,以及生产单位所用的药品原料、工具设备和工艺流程、操作者的卫生状况,是对供试品进行卫生学总评价的综合依据。
1.供试品的测定:
固体供试品,以无菌操作称取若干克,按下列方法之一进行稀释:
(1)将已称取供试品置入灭菌乳钵中加入适量稀释剂,充分研磨,然后移至于灭菌三角瓶中,共加入稀释剂100毫升,使成1∶10均匀供试液。
(2)将已称取的供试品连同100毫升的稀释剂加入灭菌三角瓶或其他相应容器内,进行振荡,使成1∶10的均匀供试液。
液体供试品,可量取10毫升加入90毫升稀释剂,混匀即得。
用1毫升灭菌吸管,吸取1∶10供试液1毫升,沿管壁注入装有9毫升灭菌的稀释剂试管内,混匀即为1∶100稀释液。
另取1毫升灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次,应换用1支1
-3
毫升灭菌吸管并充分混匀,稀释至10 或适当倍数备检。
另用1毫升灭菌吸管1支,按高倍稀释至低倍稀释的顺序分别吸取各稀释度的液体1毫升,注入直径9厘米的平皿内,或在作上述10倍递增稀释时,应稀释妥一稀释度,即可取1毫升稀释液注入平皿内。一般可根据对供试品污染情况的估计,从供试液起选择2—3个适宜稀释度进行
测定,每个稀释度各用2—3个平皿。
稀释液注入平皿后,应及时将熔化并冷至45—50℃的肉汤琼脂培养基倾注平皿内,各约15毫升,随即转动平皿使充分混合均匀。待琼脂凝固后,翻转平板,置37℃培养箱内培养至24小时和48小时,并分别计算平板内生长的的菌落。一般以48小时的菌落数为准。
为减少片状菌落的干扰,也可采用0.001%TTC琼脂,在无菌室开盖倒置或换灭菌的干燥陶瓦盖等方法使平板表面干燥后,再进行培养。
2.菌落计数方法:
先用肉眼观察,点数菌落数(霉菌不包括在内),然后持5—10倍放大镜检查有无遗漏。各平板菌落计数后,求出同一稀释度各平板生长的平均菌落数。如平板中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时,该平板不宜计数。
3、细菌菌数报告:
一般的报告方法是选取同一稀释度平均菌落数在30—300之间的平板,作为菌落总数测定的范围。如每个稀释度使用两个平板,应采用两个平板的菌落平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,或两平板菌落数相差一倍以上,此稀释度不宜采用。如每个稀释度使用三个平板,
应采用三个平板菌落数的平均数,其中有两个平板菌落数较接近,另一个平板相差在一倍以上,或有片状菌落生长时,则应采用前者平均数为该稀释度的菌落数,按下列规则乘其稀释倍数报告之。
稀释度的选择:
(1)若只有一个稀释度,平均菌落数在30—300个之间时,乘以稀释倍数报告之(见表1例1)。
(2)若两个稀释度,其平均菌落数均在30—300个之间,则应求出两者总菌数之比,凡比值小于或等于2应报告其平均数,若大于2则报告其中较小的数字。(见表1例2、3)。
(3)若所有稀释度的平均菌落数均多于300个,则应按稀释度最高的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例4)。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均少于30个,则应按稀释倍数最低的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间,其中一个稀释度大于300,而相邻的另一稀释度小于30时,则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例6)。
(6)若所有稀释度均无菌生长,报告数为<10个/克或毫升。
菌数的报告,菌数在100以内时,按实有数报告之,大于100时,采用左端前二位数字,在前两位数字之后的数值,应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数,可用10的指数来表示(见表1)。
如供试品经检验,细菌数不合格,需复验时,应重新取样,依法复试两次,细菌数仍有一次不合格时,则该供试品细菌数应判为不合格。
表1 细菌计数结果及报告方法
------------------------------------------------
\ 平均菌| 供试品稀释倍数 |两 数| 菌落 |
\ 落数 |--------------|稀 | 总数 | 细菌总数报告方式
\ | -1| -2| -3|释 之| (个/ | (个/克或毫升)
例 \ |10 |10 |10 |度 | 克或 |
次 \| | | |菌 比| 亳升) |
-----|----|----|----|---|------|----------------
| | | | | | | 4
1 |1365| 164| 20 | — | 16400| 16000|或1.6×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
2 |2760| 295| 46 |1.6| 37750| 38000|或3.8×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
3 |2890| 271| 60 |2.2| 27100| 27000|或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 5
4 |不可计 |4650| 513| — |513000|510000|或5.1×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 2
5 | 27 | 11 | 5 | — | 270 | 270 |或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
| | | | | | | 4
6 |不可计 | 305| 12 | — | 30500| 31000|或3.1×10
------------------------------------------------
二、霉菌总数测定法
霉菌总数(包括酵母菌)的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染活的酵母菌、霉菌数量,借以判明供试品的酵母菌、霉菌污染程度及其一般卫生状况。
1.供试品的测定:
供试液与稀释按细菌总数测定项下规定的方法进行。取供试液、1∶100和1∶1000的稀释液各1毫升分别注入平皿内,每个稀释度各用2—3个平皿,加入稀释液后将熔化并冷至45—50°的虎红琼脂培养基约15毫升倾入平皿内,充分摇匀。凝固后,翻转平板置25—2
8°培养72小时,计算平板内生长的霉菌菌落数。若有根霉或毛霉蔓延生长,为避免影响其它霉菌的计数时,应及时将此平板取出计数。
2.酵母菌霉菌菌数报告:
酵母菌、霉菌计数,应选取带有菌丝体的菌落和酵母菌菌落进行点数。先点清每个平板上生长的菌落数,再求出每一稀释度的平均菌落数。判定结果时,应选取平板上菌落数既清楚可数,平均又在5—50个范围以内的菌落数,乘以稀释倍数后,做为供试品的霉菌总数报告之。若有两
个稀释度的菌落数皆在5—50个以内或三个稀释度皆不在此范围之内时,应参照细菌总数测定的规则报告之。
一般眼科制剂的细菌、霉菌总数测定按上述方法进行并报告之。如抗生素或有抑菌作用的制剂,采用适宜的方法处理后,按常规方法进行。
如供试品经检验,霉菌总数不合格,需复检时,应重新取样,依法复试两次。霉菌数仍有一次不合格时,供试品应判为酵母菌、霉菌数不合格。
三、大肠杆菌检验法
大肠杆菌来源于人和温血动物的粪便。凡由供试品中检出大肠杆菌时,表明该药品已被粪便污染,患者服用后,有被粪便中可能存在的其它肠道致病菌和寄生虫卵等病源体感染的危险。因此,大肠杆菌被列为重要的卫生指标菌,是非规定灭菌口服药品的常规必检项目之一。
大肠杆菌检验程序。
表2 肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表
-------------------------------------------------------
| | |爱 | |亚 |枸 |克 | 肠 杆 菌 属 | 沙 雷 氏 菌 属 |
菌属 |艾 |志 |德 |沙 |利 |橼 |雷 |------------|------------|
|希 |贺 |华 |门 |桑 |酸 |伯 | | | 哈夫尼亚 | | | 液化 |
------|氏 |氏 |氏 |氏 |那 |杆 |氏 |阴沟|产气|------|粘 质|红色|-----|
生化特性 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 |菌 | | |37℃|22- | | |37℃|22- |
|属 |属 |属 |属 |属 |属 |属 | | | |25℃ | | | |25℃|
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
| | | | | | | | | | | | | | | |
靛基质 |+ |-/+ |+ |- |- |- |-/+ |- |- |- |- |- |- |- |- |
| | | | | | | | | | | | | | | |
甲基红 |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |+/- |- |-/+ |-/+ |+/- |-/+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
V-P反应 |- |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |+/- |+ |+ |+ |-/+ |+/- |
| | | | | | | | | | | | | | | |
西蒙氏枸橼 |- |- |- |d |+ |+ |+ |+ |+ |(+) |d |+ |+ |+ |+ |
酸盐 | | | | | | | | | |/- | | | | | |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
硫化氢(三糖|- |- |+ |+ |+ |+/- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |
铁) | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | w | | | | | | w |-, | | |
尿素酶 |- |- |- |- |- |d |+ |+/- |- |- |- |d |+)w |d | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
氰化钾 |- |- |- |- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |-/+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
动力 |+/- |- |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
明胶(22℃)|- |- |- |- |(+) |- |- |(+) |-/ | |- |+/ |+ | |+ |
| | | | | | | |/- |(+) | | |(+) | | | |
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
赖氨酸脱羧 |d |- |+ |+ |+ |- |+ |- |+ |+ |+ |+ |+/ |+/- |+ |
酶 | | | | | | | | | | | | |(+) | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
精氨酸双水 |d |-/ |- |(+) |+/ |d |- |+ |- |- |- |- |- |- |- |
解酶 | |(+) | |/+ |(+) | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
鸟氨酸脱羧 |d |d |+ |+ |+ |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |
酶 | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
苯丙氨酸脱 |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- |- | |
氨酶 | | | | | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
丙二酸钠 |- |- |- |- |+ |d |+ |+/- |+/- |+/- |d |- |+/- |- | |
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
葡萄糖产气 |+ |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+°/- |-/+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
乳糖 |+ |- |- |- |d |(+) |+ |+ |+ |-/ |- |- |+ |d |(+) |
| | | | | |/+ | | | |(+) | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
蔗糖 |d |- |- |- |- |d |+ |+ |+ |d |-/(+) |+ |+ |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
甘露醇 |+ |+/- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
卫矛醇 |d |d |- |d |- |d |-/+ |-/+ |- |- |- |- |- |- | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
水杨甙 |d |- |- |- |- |d |+ |+/ |+ |d |d |+ |+ |+ | |
| | | | | | | |(+) | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
侧金盏花醇 |- |- |- |- |- |- |+/- |-/+ |+ |- |- |d |+ |d | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
肌醇 |- |- |- |d |- |- |+ |d |+ |- |- |d |d |+ |+ |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
山梨醇 |+ |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |+ |- |+ | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
阿拉伯糖 |+ |d |- |+/ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |+ |+ |+ |
| | | |(+) | | | | | | | | | | | |
| | | | | | | | | | | | | | | |
棉子糖 |d |d |- |- |- |d |+ |+ |+ |- |- |- |+ |d |+ |
| | | | | | | | | | | | | | | |
鼠李糖 |d |d |- |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |+ |- |- |- |- |
------------------------------------------------------
------------------------------------
| 果胶杆菌属| 形 杆 菌 属 |普罗菲登斯菌属
菌属 |------|--------------|-------
------| | | | | | | |
生化特性 |37℃|22- | | | | | |
| |25℃ |普 通|奇异|摩根氏|雷极氏|产碱|司徒氏
------|--|---|---|--|---|---|--|----
| | | | | | | |
靛基质 |-/+ |-/+ |+ |- |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
甲基红 |-/+ |+/- |+ |+ |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
V-P反应 |-/+ |-/+ |- |-/+ |- |- |- |-
| | | | | | | |
西蒙氏枸橼 |d |+/(+) |d |+/ |- |+ |+ |+
酸盐 | | | |(+) | | | |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
硫化氢(三糖|- |- |+ |+ |- |- |- |-
铁) | | | | | | | |
| | w | | | | | |
尿素酶 |d |d |+ |+/ |+ |+ |- |-
| | | |(+) | | | |
| | | | | | | |
氯化钾 |+/- |+/- |+ |+ |+ |+ |+ |+
| | | | | | | |
动力 |+/- |+/- |+ |+ |+/- |+ |+ |+/-
| | | | | | | |
明胶(22℃)| |+/(+) |+ |+ |- |- |- |-
| | | | | | | |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
赖氨酸脱羧 |- |- |- |- |- |- |- |-
酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
精氨酸双水 |- |-/(+) |- |- |- |- |- |-
解酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
鸟氨酸脱羧 |- |- |- |+ |+ |- |- |-
酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
苯丙氨酸脱 |- |- |+ |+ |+ |+ |+ |+
氨酶 | | | | | | | |
| | | | | | | |
丙二酸钠 |-/+ |-/+ |- |- |- |- |- |-
------------------------------------
------------------------------------
葡萄糖产气 |-/+ |d |+°/- |+ |d |-/+ |d |-
| | | | | | | |
乳糖 |d |+/(+) |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
蔗糖 |+/- |+ |+ |d |- |d |d |(+)
| | | | | | | |/+
| | | | | | | |
甘露醇 |+/- |+ |- |- |- |+/- |- |d
------|--|---|---|--|---|---|--|----
卫矛醇 |- |- |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
水杨甙 |d |+ |d |d |- |d |- |-
| | | | | | | |
侧金盏花醇 |- |- |- |- |- |d |+ |-
| | | | | | | |
肌醇 |d |- |- |- |- |+ |- |+
------|--|---|---|--|---|---|--|----
山梨醇 |- |- |- |- |- |d |- |d
| | | | | | | |
阿拉伯糖 |d |+ |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
棉子糖 |d |+/(+) |- |- |- |- |- |-
| | | | | | | |
鼠李糖 |d |d |- |- |- |+/- |- |-
------------------------------------
注:+90%以上阳性;-90%以上阴性;(+)迟缓阳性;d有不同生化型;“微弱阳性;+°微产气;+/(+)多数阳性,少
数迟缓阳性;(+)/+多数迟缓阳性,少数阳性;+/-多数阳性,少数阴性;-/+多数阴性,少数阳性;-/(+)多数阴
性,少数迟缓阳性;(+)/-多数迟缓阳性,少数阴性;+°/-多数阳性微产气,少数阴性。
大肠杆菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----
↓稀释
-----
|供试液|
-----
↓
--------
|胆盐乳糖增菌|
--------
37°↓18—24小时
------------
|MacC平板或EMB|
------------
37°↓18—24小时
-----
|纯培养|
-----
37°↓18-24小时
-------
|染色、镜检|
-------
↓
---------------
↓ ↓
--------- ------
|IMViC试验| |乳糖发酵|
--------- ------
| |
---------------
↓
-----
|报 告|
-----
(一)增菌培养:
取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
(二)分离培养:
将上述增菌培养物,划线接种于麦康凯琼脂(MacC)或伊红美兰(EMB)琼脂平板上,置37°培养18—24小时,检查有无疑似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、粉红色;在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑
湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选。
(三)纯培养:
至少挑选2—3个疑似大肠杆菌菌落,分别接种于肉汤琼脂斜面或三糖(双糖)铁琼脂斜面,置37°培养18—24小时。
(四)染色镜检:
将疑似大肠杆菌的纯培养物涂片、革兰氏染色。经染色镜检证明,为革兰氏阴性短杆菌者,应继续做生化试验。
(五)生化试验:
1.乳糖发酵试验
将上述纯培养物接种于乳糖发酵管,置37°培养24—48小时,凡大肠杆菌,可发酵乳糖产酸产气,或产酸不产气时,加用酸性复红指示剂的应显红色;加BTB指示剂时显蓝色。产气者,倒管内有气泡。
2.IMViC试验:
①靛基质试验:将纯培养物接种于蛋白胨水,置37°培养24—48小时,沿管壁加柯凡克氏试剂0.3—0.5毫升,轻微摇动,静置片刻,观察液面。阳性反应,液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。
②甲基红试验:将纯培养的菌苔接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37℃培养24—48小时,加入甲基红试剂数滴,观察结果。阳性反应呈鲜红色或桔红色;阴性反应呈黄色。
③V—P试验:将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37°培养48小时,按培立脱法先加6%a-萘酚无水乙醇溶液1毫升,再加40%的氢氧化钾溶液0.4毫升,轻摇后观察结果。阳性反应,加入试剂后,应在15分钟内显红色、深红色。如不明显,可延长至
4小时。
④枸橼酸盐利用试验:将纯培养的菌苔接种于西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面,37°培养24小时,观察结果。阳性反应,斜面有菌苔生长,培养基由绿色变为蓝色。阴性反应斜面无菌苔生长,培养基仍为绿色。当见有微量或痕迹生长的可疑现象时,应将待检菌株分离,纯化后再行试验。
(六)供试品检验报告:
供试品增菌后,在麦康凯或伊红美兰琼脂平板上分离的疑似大肠杆菌,经证实为革兰氏阴性短杆菌,乳糖发酵试验阳性,IMViC试验呈++--或-+--反应者,应即报告供试品检出大肠杆菌。〔注〕
大肠杆菌及其他致病菌检查按一次检出结果为准,不再抽样复试。
〔注〕关于大肠杆菌的IMViC反应的说明
大肠杆菌IMViC试验的模式反应,在一般情况下应为“++--”或将“-+--”也包括在内,共代表了绝大多数大肠杆菌(占99%)的实际反应结果,因而受到了国际上的广泛承认,并将其列为大肠杆菌的常规鉴别IMViC反应公式。但个别大肠杆菌的IMViC反应,
也可能出现“+---”和“++-+”等等异常现象。由于这种异常反应出现的频率极少,没有普遍性的代表意义,因而在分类鉴别和统计学上,可以忽略不计。
四、沙门氏菌检验法
沙门氏菌主要寄生在人体、哺乳动物和家禽的肠道内,可随同粪便的排泄污染水源,食品与药品。沙门氏菌的种类繁多,有些对人有致病力,如伤寒沙门菌和副伤寒沙门氏菌;有些对动物有致病力,如鸭沙门氏菌和雏沙门氏菌;尚有一些对人和动物皆有致病力,如肠炎沙门氏菌、鼠伤
寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等。它们能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等。
带有这些细菌的人与动物常可直接或间接地污染药品的生产环境、工具设备和原料辅料,以及半成品和成品等。特别是用动物脏器制成的药品,污染机率较高,影响患者用药安全,并有可能通过药品的流通而传播。故将沙门氏菌,应列为某些药品的必检项目。
沙门氏菌检验程序。
沙门氏菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----
↓稀释
-----
|供试液|
-----
↓
----------
|胆盐乳糖增菌培养|
----------
37°↓18—24小时
----------
|SS与EMB平板|
----------
37°↓18—24小时
-------
|三糖铁琼脂|
-------
37°↓18—24小时
-------------------------
| | | |
--- --- --- -------------
|动| |镜| |凝| | 一般生化反应 |
| | | | |集| |-----------|
| | | | |试| |葡乳麦甘蔗靛硫尿赖脱氰|
|力| |检| |验| |萄 芽露 基化素氨羧化|
| | | | | | |糖糖糖醇糖质氢酶酸酶钾|
--- --- --- -------------
| | | |
-------------------------
↓
-----
|报 告|
-----
(一)增菌培养:
取1∶10供试品稀释液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
(二)分离培养:
取上述增菌培养物,划线接种于SS琼脂和EMB琼脂平板各一个(划线时,适当增加SS琼脂平板的涂抹量2—3环,可提高阳检率),置37°培养18—24小时。凡沙门氏菌,在SS和EMB琼脂平板上,菌落一般无色透明或半透明,圆形,周边整齐,表面光滑湿润,在SS
琼脂平板上中心有时呈黑褐色。如有上述疑似菌落,应选取2—3个分别进行纯培养,按下列方法鉴别。
(三)初步鉴别:
将上述纯培养物分别穿刺并划线接种三糖铁(TSI)琼脂,置37°培养18—24小时。凡在TSI琼脂中不分解乳糖及蔗糖(即上部斜面呈碱性,不变色),下层底部分解葡萄糖呈酸性变黄色(有气泡或无气泡),有动力或无动力,以及产生或不产生黑褐色的硫化氢反应,并经
涂片染色镜检为革兰氏阴性杆菌,都应继续做生化试验和血清学检查。
(四)生化试验:
取上述疑似菌落的纯培养物、分别接种至葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等发酵管培养基,并接种蛋白胨水和尿素培养基,经37°培养2—5天,观察结果。沙门氏菌一般生化反应和动力检查,绝大数应为、葡萄糖+,乳糖-,麦芽糖+,甘露醇+,蔗糖-,靛基质-,硫化
氢+,尿素酶-,动力+。当一般生化试验符合时,应做赖氨酸脱羧酶及氰化钾试验。沙门氏菌赖氨酸脱羧酶试验+,氰化钾-。系统生化试验,详见表2:肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表。
(五)动力试验:
取上述纯培养物穿刺接种半固体培养基,于37°培养24小时后,观察动力表现。无动力表现的培养物,应在室温(25°左右)保留2—3天后,再观察。
(六)血清学检查:
取上述疑似菌落的TSI琼脂培养物少许,与沙门氏菌A—F多价O血清作玻片凝集试验,并以生理盐水作对照试验。若凝集试验为阴性反应时,应将菌苔制成浓菌液在100℃水浴中保温30分钟后再进行A—F多价O血清凝集试验。将反应结果,结合生化试验,判定之。
(七)供试品检验报告:
凡菌落形态与初步鉴定符合下列情况分别报告如下:
-----------------------------------------
血 清 | A—F多 |生理| 一般|
| 价O血清 | | |
-----------|----------|盐水| 生化| 报告
待 检 菌 | | 100°| | |
-----------| 菌苔 | 03′ |对照| 反应|
顺 序 | | | | |
-----------|----|-----|--|---|-----------
1 | + | | - | 符合|检出沙门氏菌
| | | | |
2 | + | | - |不符合|转有关部门进一步检定
| | | | |
3 | - | + | - | 符合|检出沙门氏菌
| | | | |
4 | - | + |- |不符合|转有关部门进一步检定
| | | | |
5 | - | - |- |不符合|未检出沙门氏菌
| | | | |
6 | - | - |- | 符合|转有关部门进一步检定
-----------------------------------------
五、绿脓杆菌检验法
假单胞菌属的绿脓杆菌对人类有致病力,同药品卫生有关。特别在大面积的烧伤、烫伤患者,眼科疾病和其他外伤方面,常因感染绿脓菌后病情加重,造成患者伤处化脓,并可引起菌血症等,眼角膜溃疡甚至失明,损害病人健康。因此一般眼科制剂和外伤用药,规定不得检出绿脓杆菌
。
绿脓杆菌检验程序(见次页)。
绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别见表3。
(一)增菌培养:
取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖培养液内,置37°培养18—24小时。
增菌后,如有绿脓杆菌生长,液体表面多有一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
一般滴眼剂如为抗生素或有抑菌作用的供试品,取样4毫升,用滤膜法处理后,将薄膜分成4片,分别接入100毫升的胆盐乳糖增菌液两瓶中,其中一瓶接阳性菌作对照。置37°培养18—24小时。
(二)分离培养:
取上述增菌培养物(应尽量从培养液的薄菌膜部位挑取),划线在十六烷三甲基溴化铵或明胶十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上,置37°培养18—24小时。
凡绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵平板上或在明胶十六烷三甲基溴化铵平板上其菌落扁平无定形周边扩散或略有蔓延,表面湿润,菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性蓝绿色色素,在含有明胶平板上除上述形态外,菌落周围呈现明胶液化环。
挑取疑似绿脓杆菌菌落2—3个进行纯培养。
(三)染色镜检:
挑取疑似菌落纯培养物、涂片、革兰氏染色,经镜检为阴性杆菌者,应进行氧化酶试验。
(四)生化试验
1.氧化酶试验
取一小块白色洁净的滤纸片放在平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌疑似菌落的纯培养物,涂在滤纸片上,然后滴加一滴新鲜配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液于培养物上,在30秒钟之内,纸片上的待检培养物出现粉红色,并逐渐变为紫红色时,即为氧化酶试验阳性。若培养物
不变色,氧化酶试验阴性,供试品可按未检出绿脓杆菌报告。
2.绿脓菌素试验:
挑取纯培养物分别接种在专供测定绿脓菌素用的PDP琼脂斜面培养基上,置37°培养24小时后,在试管内加氯仿3—5毫升,充分振摇,将琼脂斜面培养物中的待检色素提取在氯仿液里。待氯仿提取液呈蓝绿色时,用吸管将其移到另一试管中,并在该液中加1N的盐酸1毫升左
右,振摇后,静置片刻,如果在上层的盐酸液内出现粉红色时,即为阳性,表明被检菌的培养物中有绿脓菌素存在。如阴性,应继续将纯培养物接种在PDP琼脂斜面上,37°培养2—3天后,检查有无绿脓杆菌素产生。
3.硝酸盐还原产气试验:
绿脓杆菌检验程序图解
-----
|供试品|
-----
↓
-----
|供试液|
-----
↓
--------
|胆盐乳糖增菌|
--------
37° ↓18—24小时
---------------
|十六烷三甲基溴化铵平板或明|
|胶十六烷三甲基溴化铵平板 |
---------------
37° ↓18—24小时
-----
|纯培养|
-----
↓
-------
|染色、镜检|
-------
↓
-------
|氧化酶试验|
-------
|
(-) -------------------- (+)
↓ ↓
阴 性 --------
↓ |绿脓菌素试验|
----- --------
|报 告| (一) ↓ (+)
----- ------------
↓ ↓
----------------- -----
↓ ↓ ↓ |报 告|
-----
------ ------- ---------
|明胶液化| |硝酸盐还原| |42°生长试验|
| 试验 | |产气试验 | | |
------ ------- ---------
| | |
----------------------
↓
-----
|报 告|
-----
表3 绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别表
---------------------------------------------------
|分离 | 色素 | | | | | | | |
鉴 别 培 养 |---|-----------| |氧|氧| |精解|硝 产| |42
| | | | |鞭 |化| | 乙 |氨 |酸 |液|生
-----------|十六烷| 绿 | 萤 | 其 |毛 |葡|化| 酰 |酸 |盐 |化|长
|三甲基| 脓 | 光 | 他 |染 |萄| | 氨 |双 |还 |明|试
菌 种 |溴化铵| 菌 | 色 | 色 |色 |糖|酶| 酶 |水酶|原 气|胶|验
|琼脂 | 素 | 素 | 素 | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
绿脓杆菌 | + |+/-|+/ |+/-|端极|+|+| + |+ | + |+|+
(P. aeruginosa) | | | | |单毛| | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
萤光假单胞菌 |-/+| - |+/-| - |端极|+|+|-/+|+ |-/+|+|-
(P. fluorescens) | | | | |多毛| | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
恶臭假单胞菌 |-/+| - |+/-| - |” |+|+|-/+|+ | - |-|-
(P. putida) | | | | | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
洋葱假单胞菌 |+/-| - | - |-/+|” |+|+| + |- | - |+|+/-
(P. cepacia) | | | | | | | | | | | |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
不分页显示 总共3页 1 [2] [3]
下一页